搜索

企業面貌     加入學習     在線留言     招賢納士      聯系方式     活動報名

科研服務

 


我們的產品

微信公眾號

傳真:+8625-58603278
郵箱:
njfish365@163.com
地址:南京市江北新區永寧街道琥珀路1號
浦口經濟開發區低碳谷

版權所有:南京堯順禹生物科技有限公司      備案號:蘇ICP備12063614號-2     網站建設:中企動力  南京

關于我們    

基因組編輯相關試劑     斑馬魚研究相關試劑與耗材     
水生模式動物斑馬魚活體材料

斑馬魚專業服務     細胞建系服務     大小鼠基因編輯服務     個性化服務

搜索
搜索

斑馬魚基因敲除突變體建立

瀏覽量:

1.敲除原理

  功能缺失---基因敲除 (Gene Knockout)

  基因敲除 :將斑馬魚基因改變成無功能性基因(無效等位基因:null allele)的一種遺傳學技術

  【A gene knockout (KO) is a genetic technique in which one of an organism‘s genes is made inoperative. http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockout 】

  通過將基因敲除的個體與正常個體相比較,研究者可以揭示特定基因的功能。

  基因敲除技術特點:在基因組水平上將目標基因修改成無效等位基因,遺傳背景干凈清晰,是研究基因功能的金標準。

 

2.服務流程

 

3.服務信息

流程分布

周期(工作日)

提交內容

基因信息分析

2

專業分析報告

sgRNA合成

9

獲得sgRNA并提供sgRNA合成階段報告

sgRNA活性驗證

5-10

獲得有活性的sgRNA并提供活性報告

F0代突變體鑒定

40

獲得F0代突變體3對并提供鑒定報告

F1代突變體獲得

60

提供3尾F1代突變體并提供總結報告

總周期:5-6個月

 

 

 


案例說明
案例展示

案例說明

利用CRISPR技術建立動物基因敲除突變體的實驗流程

(以斑馬魚基因為例)

  一、基因結構及功能的生物信息學分析

  二、CRISPR 設計

  三、目標序列的野生型等位基因的測序驗證

  3.1 擴增目標基因組片段的引物設計

  3.2 基因組DNA模板制備

  以斑馬魚為例,隨機選取5枚24 hpf胚胎,以《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》(南京堯順禹生物科技有限公司)制備斑馬魚基因組DNA模板。

  3.3 PCR產物電泳及測序驗證

  四、sgRNA體外表達模板的制備(質粒模板法)

  本實驗流程以南京堯順禹生物科技公司的二合一質粒pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA(含sgRNA骨架的質粒)質粒特征所設計。

  4.1 CRISPR寡核苷酸DNA(Oligo)對的設計

  4.2 向可信賴的商業公司訂購上述DNA引物(共2條,每個2 OD,RPC純化即可)。

  4.3 將正反向兩個引物進行退火

  4.4 將退火產物與線性化的pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA骨架質粒連接

  4.5 轉化

  4.6 轉化子鑒定

  2%瓊脂糖凝膠電泳,陽性克隆應出現113 bp的條帶(圖1):

  

 

圖1:PCR驗證陽性克隆。Lane1:DNA Marker (從下往上, 100bp, 250 bp, 500bp, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp);Lane 2-4: 陰性轉化子; Lane 5-9: 陽性轉化子

  4.7 測序驗證

  送2個經PCR驗證有陽性條帶的菌液去商業公司測序,測序引物為F-sgRNA,確認CRISPR序列(去除PAM位點)和骨架序列重組到pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA質粒中;同時,將同樣的細菌接種在10 ml含氨芐青霉素的LB管中,37oC條件下搖菌過夜。

  4.8 質粒抽提

  4.9 sgRNA模板的制備

  以上述質粒為模板,選用引物F-sgRNA和引物R-sgRNA作為一對引物,用高保真DNA聚合酶,通過PCR的方式,進行sgRNA模板的制備。

  五、sgRNA體外轉錄

  用Maxiscript T7 Kit (Ambion)試劑盒,按說明書的要求進行sgRNA的體外轉錄。

  說明:由于sgRNA在細胞內發揮作用的是RNA的形式,因而不需要戴帽以及加尾等操作。

  5.1 20 ml體外轉錄體系(依次加入)

  sgRNA模板:12 ml

  10mM ATP: 1 ml (NTP均需在冰上溶解)

  10mM CTP: 1 ml

  10mM GTP: 1 ml

  10mM UTP: 1 ml

  T7 RNA polymerase:2 ml

  10 × Transcription Buffer:2 ml (先在室溫下溶解,然后Vortex,再離心后使用)

  5.2 將上述溶液充分混勻后,離心,然后置于37℃水浴鍋中孵育1h。

  5.3 向反應體系中加入1ml DNase I,混勻,再次于37℃水浴鍋中孵育15min。

  5.4 向反應體系中加80 ml DEPC處理過的超純水,10 ml 無RNase的3M醋酸鈉(pH5.2),渦旋混勻,然后加300 ml 無RNase的無水乙醇(購買來未打開過的新的無水乙醇可視為無RNase,于-20℃中驟冷1小時以上。

  5.5 4℃,12000g 離心20min,棄上清。

  5.6 以70% 無RNase的乙醇清洗沉淀,4℃,12000g 離心5min,棄上清。

  5.7 然后再快速離心,將掛在離心管壁上的液體用移液器小心吸出。

  5.8 通風櫥中(打開抽氣開關)干燥(20min左右),若較長時間仍不能將沉淀物干燥,再次于4℃,12000g 離心5min,將掛在離心管壁上的液體用移液器(小量程的移液器)小心吸出。

  5.9 加10 ml DEPC處理超純H2O 溶解沉淀。

  5.10 取0.5 ml sgRNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測轉錄出的sgRNA條帶的完整性(圖2),并用紫外分光光度計測量轉錄出的sgRNA的濃度。

  5.11 合成出的sgRNA應及時進行分裝,保存在-80oC冰箱中,不要反復凍融,以免影響其質量。

  

 

圖2、sgRNA (第2條泳道為sgRNA)

  六、sgRNA活性的測試

  將上述sgRNA和Cas9 蛋白混合,顯微注入斑馬魚受精卵,注射量為1nl。待胚胎發育至7-24 hpf時,取5枚胚胎,使用本公司生產的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板,方法同前。

  然后以引物對F-gene和R-gene進行PCR擴增,將PCR產物分別亞克隆到pGEM-T Easy載體中。以引物對T7和Sp6對轉化子進行擴增,以篩選驗證。

  對篩選到的陽性轉化子,以T7和Sp6擴增產物為模板,F-gene和R-gene再次進行PCR擴增。然后,依據條帶大小,選20個克隆,5個一組,PCR產物等量混合后直接送測序。直接閱讀測序圖,只要其中任何一組出現有套峰,即假定制備的sgRNA活性不小于5%(1/20)。

  

 

圖4 典型的測序套峰圖

  七、斑馬魚靶向基因突變體F0代的建立

  將上述經過驗證有活性的sgRNA和Cas9 蛋白等量混合后,按上述相同的方法顯微注入斑馬魚受精卵。然后將按常規飼養,當生長至兩月齡時,剪取尾鰭,按前述同樣的方法進行擴增目標基因組DNA片段。將獲得的PCR產物直接送測序,確認體細胞含靶向突變。然后將斑馬魚飼養至性成熟,共獲得約50尾后代。

  

 

圖5 典型的體細胞含靶向突變的測序套峰圖

  八、斑馬魚基因靶向突變F1代的制備

  收取F0自交的胚胎,獲得不少于100尾以上的F1。將F1按常規飼養至2個月時,選取10尾魚,剪尾鰭,按前述方法進行基因型鑒定。簡單地說,用南京堯順禹生物科技有限公司的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板,再以引物對F-gene和R-gene進行PCR擴增。將PCR產物直接送測序,通過直接讀測序的色譜圖,確認每一位魚是否攜帶等位基因突變。

  九、基因靶向突變體的擴群建系

  將攜帶基因靶向突變的F1突變體和野生型交配,獲得F2群,完成基因靶向突變體的建系擴群。

參考文獻
參考文獻

參考文獻

參考文獻

技術咨詢

科研服務

SCIENTIFIC SERVICE

河北11选五 天水市 永康市 成都市 商洛市 大庆市 镇江市 临夏市 阜新市 巴中市 萍乡市 崇州市 邓州市 平度市 河津市 台中市 衡水市 明光市 凤城市 吉林省 石首市 龙海市 黄石市 叶城市 都匀市 武穴市 朝阳市 青岛市 凤城市 葫芦岛市 仙桃市 合肥市 孝感市 邢台市 兴城市 平度市 利川市 洮南市 信阳市 常州市 宁国市 南阳市 徐州市 北宁市 邢台市 鹿泉市 池州市 北宁市 台中市 华阴市 延吉市 铁力市 兴城市 淮安市 汉川市 东阳市 焦作市 西安市 佛山市 潍坊市 甘肃省