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人類疾病的斑馬魚模型-----斑馬魚胚胎藥篩平臺

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  斑馬魚在國際上已廣泛應用于藥物早期安全性評價和毒理學研究,輝瑞、默克、強生、阿斯利康等跨國醫藥巨頭都在用斑馬魚進行藥物早期安全性評價。FDA和EMA早在2009年就通過了對斑馬魚安全藥理學數據的GLP檢查。中國重大新藥創制專項自2012年開始將斑馬魚藥物安全性評價技術列為了關鍵技術開發課題之一,并連續滾動支持。隨著斑馬魚全基因組和人類基因組相關性比對分析工作的完成,斑馬魚在人類疾病未知基因研究、疾病表型分析以及通過高通量體內藥物篩選平臺開發潛在治療藥物方面發揮了重要作用。

  斑馬魚在藥物篩選中有其獨特的優勢:它不僅具有體外細胞實驗的優點,同時也作為脊椎動物具有體內實驗的優勢,完美的結合了體內外實驗的優勢。

  與細胞模型相比具有生物、靶點和一藥多篩的優勢

  生物優勢:斑馬魚是整體作為藥物受試對象,可同時監測藥效和毒性,以便在實驗開始時排除掉毒性大的化合物,大大降低誤篩率;且斑馬魚胚胎透明,可鏡下直視或通過免疫熒光、整體原位雜交等技術觀察表型變化,降低藥篩成本。

  靶點優勢:斑馬魚與人類基因的同源性高,可以針對某個生物學表型而不是靶點進行藥篩,可以尋找到未知的藥物靶點。

  一藥多篩:可同時觀測分析多個器官系統的表型。

 

 

  與哺乳動物小鼠相比具有高通量、低費用、給藥方便等優勢

  高通量:斑馬魚產卵數量多,且受精后的7天卵黃可提供胚胎營養而不用喂食,方便用96孔或384孔板進行藥物篩選;藥物研發過程中,不是所有合成或者分離出來的化合物都能有理想的活性,往往需要對大批量的藥物庫逐步進行篩選,這時可以通過斑馬魚高通量篩選快速選出有活性的化合物(先導化合物),指導后續研發工作。

  低費用:斑馬魚飼養和消耗的費用遠遠低于實驗鼠,平均每天每只消費約為實驗鼠的1/100。

  給藥方便:斑馬魚皮膚具有通透性,給藥過程簡單,容易操作,而且易于進行大規模的藥物篩選,可直接將化合物溶于水擴散至胚胎中,所需化合物的量僅為實驗鼠的1/100-1/1000。

 

 

  近年來,已經有一些研究團隊使用斑馬魚在血液、心血管疾病、糖尿病和肥胖癥、神經退行性疾病以及癌癥等領域進行研究工作并取得一定的成果。

  血液和心血管疾病

  由于斑馬魚胚胎很小, 可以通過被動擴散跟環境交換氧氣和二氧化碳, 所以即使沒有血液循環,斑馬魚胚胎仍舊可以存活5 d ,非常有利于研究血液和心血管發育缺陷。

 

 

  哈佛大學醫學院的Zon課題組以造血干細胞分子標記runx1/cmyb 的表達譜為指標, 用斑馬魚胚胎來篩選調節造血的化合物, 發現了前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)能顯著增加造血干細胞的數量, 同時又不引起胚胎發育異常。前列腺素E2在小鼠中具有同樣的功能。盡管前列腺素E2 已經是臨床藥物, 主要用于引產, 但是以前人們并不知道它還能促進造血。目前, 前列腺素E2 的穩定修飾物16,16-Dimethyl Prostaglandin E2(dmPGE2)已進入臨床研究。哈佛大學醫學院與制藥公司Fate Therapeutics等機構合作, 用dmPGE2 來促進人臍帶血細胞移植后的增殖(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00890500)。dmPGE2 是第一個進入臨床實驗的始于斑馬魚篩選的藥物, 有力的證明了斑馬魚藥物篩選的效力和潛力。

 

 

Yunyun Yue, Mingyang Jiang, Luqingqing He, Zhaojunjie Zhang, Qinxin Zhang, Chun Gu, Meijing Liu, Nan Li, Qingshun Zhao*. 2018. The transcription factor Foxc1a in zebrafish directly regulates expression of nkx2.5, encoding a transcriptional regulator of cardiac progenitor cells. The Journal of Biological Chemistry, 293(2):638-650. 

 

糖尿病和肥胖癥

 

 

  神經退行性疾病

  神經毒素1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) 能誘導哺乳動物帕金森病模型。斑馬魚的神經系統跟人類似, 胚胎用MPTP 處理后, 同樣發生多巴胺能神經元數量減少和運動遲緩, 這種病理表型可以被Deprenyl 拯救,而且MPTP 和Deprenyl 的作用機制在人和斑馬魚間是保守的, 都要通過單胺氧化酶[44, 45]來起作用。可見, 斑馬魚是很好的帕金森病模型, 而且斑馬魚胚胎沒有血腦屏障, 有利于藥物進入腦。

 

 

Guo, S. (2009). Using zebrafish to assess the impact of drugs on neural development and function. Expert opinion on drug discovery 4, 715-726 

 

  癌癥

  Zon 課題組用斑馬魚胚胎進行藥物篩選, 發現了雙氫乳清酸酯脫氫酶 (Dihydroorotate dehydrogenase, DHODH)的抑制劑, 比如來氟米特(Leflunomide), 能抑制神經脊細胞發育。在哺乳動物模型里的實驗表明, 通過抑制DHODH 可以有效抑制黑素瘤在體外和體內的增殖。Leflunomide 也被批準進入了臨床實驗, 與Vemurafenib 聯合用藥治療黑素瘤(ClinicalTrials.gov Identifier NCT01611675)。

 

 

(Patton, E.E., Widlund, H.R., Kutok, J.L., Kopani, K.R., Amatruda, J.F., Murphey, R.D., Berghmans, S., Mayhall, E.A., Traver, D., Fletcher, C.D., et al. (2005). BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB 15, 249-254 )

 

  藥效學篩選和安全性評價

  斑馬魚不僅可以適用于多種藥物種類,還能進行多種類型的藥效學評價和安全性評價。藥物類型包括中藥、天然產物、小分子藥和成品藥物(新適應癥開發)。

  藥效學評價涉及領域:腫瘤、眼科、骨科、耳科、中樞神經、消化系統、脂質代謝、皮膚色素、組織再生、免疫與炎癥等。

  此外通過斑馬魚實驗在早期能快速發現安全性不佳(干擾胚胎發育、引起表型變化等)的候選化合物,可以有效降低后期研發失敗風險和成本,美國食品藥品監督管理局(FDA)已經越來越多地應用斑馬魚對臨床前藥物進行安全性與毒理性評價。如美國FDA國際毒理研究中心(NCTR)評價氯胺酮(ketamine,一種被美國FDA嚴格管制的兒科麻醉劑)對斑馬魚心血管和神經系統的毒性,結果發現氯胺酮能夠降低斑馬魚的心率,減少斑馬魚的運動神經元數量,和人類臨床試驗完全一致。

 

  我們團隊在趙慶順教授的帶領下,基于基因組編輯技術開發制備具備自主知識產權的人類疾病的斑馬魚模型,如斑馬魚心血管模型、肥胖癥模型、運動神經模型、腫瘤模型等,取得了一定的研究成果,為生物醫藥產業鏈提供斑馬魚藥篩平臺這一重要的鏈接。

 

 

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