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NBT | 陳斯迪組建立新型AAV轉座子CRISPR篩選技術并在CD8 T細胞上篩選出膠質母細胞瘤免疫治療新靶點

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近年來,腫瘤免疫療法給無數的腫瘤患者帶來了希望。免疫檢查點療法是當前腫瘤免疫治療的核心,PD-1或是其配體PD-L1以及CTLA4抗體在部分腫瘤治療過程中表現非常優越。這也逐漸讓免疫檢查點療法成為臨床一線標準療法。由此可見,免疫檢查點療法的重要性不言而喻,這也讓該領域的開創者James Allison 和 Tasuku Honjo 贏得了2018年諾貝爾生理醫學獎。然而,對于患有膠質母細胞瘤(Glioblastoma, GBM)的患者而言,免疫檢查點療法的作用微乎其微。這也許跟膠質母細胞瘤以及大腦環境的特殊性密切相關。

 

膠質母細胞瘤是一種非常常見并且致死率最高的一類腦瘤,患者的生存期一般不超過15個月。目前主要的治療手段是手術,化療和放療,但這些都只能短期內產生部分療效,且具有較強的毒副作用【1】。在過去的25年里,膠質母細胞瘤的治療并沒有突破性的進展,除了替莫唑胺藥物化療結合放療可以稍微延長患者的生存時間。目前為止還沒有免疫治療相關的藥物可用于膠質母細胞瘤的治療。除了免疫檢查點治療外,嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)是另一類非常有希望攻克腫瘤的治療手段,其原理主要是通過改造T細胞的基因使其可以更加特異的識別腫瘤抗原,并高效的將腫瘤細胞殺死。這類系統已經在血液瘤治療中得到了充分的證明,美國FDA已經批準了多款CAR-T治療方案用于血液瘤的臨床治療。CAR-T治療在實體瘤中仍然面臨諸多困難,膠質母細胞瘤又是實體瘤中難治的代表之一。總而言之,目前尚沒有很好的免疫檢查點和CAR-T治療手段可以用于臨床的膠質母細胞瘤的治療。因此,尋找和開發更加高效的實體瘤免疫治療手段是當前的研究熱點,同時也是該領域的難點。

 

2019年9月23日,來自美國耶魯大學醫學院的陳斯迪(Sidi Chen)團隊在Nature Biotechnology上發表題為In vivo CRISPR screening in CD8 T cells with AAV–Sleeping Beauty hybrid vectors identifies membrane targets for improving immunotherapy for glioblastoma 的一項研究。作者從膠質母細胞瘤模型入手,通過CRISPR篩選技術并結合腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)和“睡美人”(Sleeping Beauty)轉座子系統篩選得到了多個新型的腫瘤免疫治療新靶點。該項目第一作者是葉露鵬博士和MD/PhD學生Jonathan Park(樸俊英)Matthew Dong(曾家寶) 。值得一提的是,這是該團隊繼上個月在Cell上發表的第二篇關于CRISPR篩選用于腫瘤免疫治療新靶點發現的文章,Matthew Dong和葉露鵬博士同樣是Cell文章的第一作者 (詳見BioArt報道:Cell | 陳斯迪組首次在CD8 T 細胞中實現體內全基因組CRISPR 篩選并發現全新的免疫治療新靶點)。

 

 

 

 

作者首先構建了一個膜蛋白相關的基因敲除文庫,希望通過CRISPR 篩選技術找出全新的免疫治療新靶點。高效的基因編輯鼠源CD8 T 細胞一直是該領域的難點,常規的細胞轉染和慢病毒遞送方法都無法實現高效的基因打靶。在本研究中,作者發現用腺相關病毒(AAV)遞送sgRNA可以很好的實現基因打靶。然而,AAV是一類非整合的病毒,隨著細胞的增殖,AAV 會慢慢的丟失。為了能讓AAV遞送的DNA元件可以整合到細胞的基因組,研究人員在AAV 載體上裝了一個超高活性的“睡美人”轉座子,這樣可以利用轉座子系統將包裹在AAV 中的DNA元件整合到基因組中,這在后續的篩選實驗中非常重要。研究人員將膜蛋白相關的基因打靶文庫克隆到AAV-SB-CRISPR 在體中,然后包裝成AAV病毒之后感染CD8 T 細胞,最后將T 細胞通過尾靜脈注射到患有GBM的小鼠體內。篩選結果顯示Pdia3,Mgat5,Emp1,Lag3,Pde5a,Ccdc80,Defb26等多個基因得到了高度的富集。值得一提的是,研究人員做了三次獨立的在體篩選,發現Pdia3,Mgat5Emp1驚人的富集在三次的篩選中。

 

 

為此,在后續的驗證實驗中研究人員重點對Pdia3, Mgat5Emp1這三個基因進行了驗證,尤其是Pdia3,在免疫治療領域從來沒有被報道過。在抗原和CD8 T 細胞特異識別的實驗中,作者發現Pdia3, Mgat5或Emp1敲除的CD8 T 細胞可以增強T細胞的抗腫瘤活性,延長了小鼠的生存時間。與對照組相比,腫瘤浸潤T細胞的比例也有了顯著地提高。研究人員還嘗試了顱內直接注射Pdia3或Mgat5敲除的CD8 T 細胞,發現同樣可以延長小鼠的生存時間。跟進實驗結果顯示 Pdia3敲除后顯著地提高了促炎癥相關基因的表達, 結果顯示T 細胞激活信號通路(T cell signaling pathway)變得更加靈敏,只需低濃度的CD3刺激便可快速的激活T細胞. 研究人員嘗試了三陰乳腺癌模型,發現T細胞Pdia3敲除也可以明顯的限制腫瘤的生長. 作者同樣在人CD8 T 細胞中進行了驗證。研究人員首先建立了PDIA3敲除的人CD8 T細胞,發下PDIA3敲除之后同樣提高了 T 細胞功能和一些共刺激因子的表達。最后作者構建了膠質母細胞瘤的CAR-T 細胞,在體外殺傷實驗中,PDIA3敲除的EGFRvIII CAR-T細胞具有更強的腫瘤殺傷能力。

 

總之,本研究對傳統CRIPSR篩選技術進行了優化,將CRISPR篩選系統與AAV和轉座子結合起來,提供了一個全新且高效的CRIPSR篩選方法。作者利用該方法對膜蛋白進行了篩選,最終得到了多個全新的腫瘤治療新靶點,為今后抗腫瘤免疫治療提供了新思路和新手段。

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