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過去CRISPR系統無法靶向的特異性突變將迎來轉機

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麻省理工學院用新方法發現了一種新Cas9酶,僅需1個G的PAM序列PAM將大大增加CRISPR-Cas系統在基因組中潛在靶標數量。過去CRISPR系統無法靶向的特異性突變將迎來轉機。新的ScCas9與原來常用的SpCas9共享89.2%的序列相似性,預計其克隆生產以及應用到已有體系或許不會太困難。

 

CRISPR-Cas9系統需要與靶標相鄰的PAM序列以促進Cas9酶識別和結合至該位點(CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的,一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對,另一部分是Cas9蛋白和一個短DNA序列,這個短的 DNA序列通常在靶DNA的3'末端發現,被稱為protospacer adjacent motif,PAM)。

 

目前, SpCas9( 來自Streptococcus pyogenes)和SaCas9(來自Streptococcus aureus)所識別的PAM序列多含鳥嘌呤/胞嘧啶(G/C-rich),因此利用已報導的堿基編輯系統無法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集(A/T-rich)區域進行精準堿基編輯操作。特別是最常用的SpCas9酶需要GG PAM序列進行識別,以至于其作用限制僅為基因組的9.9%,靶向區域十分局限。

 

為了解決這個問題,研究小組開發了一種名為SPAMALOT(Search for PAMs by Alignment of Targets)的分析軟件(通過目標隊列來搜索PAM),對細菌基因組進行生物信息學搜索,以尋找是否存在任何具有限制性較低的PAM的Cas9樣酶序列。然后,他們從生物信息學搜索中創建出最佳匹配的合成版本,并評估了它們在CRISPR系統中的效用。

 

他們發現了一種特別有效的酶ScCas9,與SpCas9有著驚人的相似之處,來自 Streptococcus canis bacteria。有別于雙G PAM識別,ScCas9僅需1 個G的PAM序列,這使其在基因組中的靶區域明顯大于SpCas9,可以靶向將近50%的基因組區域,研究成果發表在《Science Advances》雜志。

 

 

“這種酶看起來幾乎與最初發現的酶相同......但它能夠靶向常用酶不能的DNA序列,”共同主要作者麻省理工學院Pranam Chatterjee這么解釋。

 

ScCas9的發現為基因治療帶來新希望

過去CRISPR系統無法到達的特異性突變,采用ScCas9后或將迎來轉機。例如,基因的典型長度大約為1000個堿基,如果治病目標是敲除單基因的多個不同位置,研究人員可能更傾向選擇簡單地敲除整個基因。但是,像鐮狀細胞性貧血這種單一堿基突變引起的疾病,ScCas9酶可以更精確地加以校正。“堿基編輯可不是隨意在1000個堿基上打靶,然后亂敲一氣,”Jacobson說。“你需要去到非常精確的位置,把CRISPR機器放在它旁邊,然后給它一個堿基編輯器(另一個與CRISPR相連的蛋白質),進去修理或改變堿基。

 

新工具在這種情況下特別有用。法國國家自然歷史博物館的CRISPR專家Jean-Paul Concordet(未參與本研究)評價:他們完美地利用了鏈球菌Cas9序列的自然進化,開辟了新基因組編輯工具挖掘的有力途徑。

 

ScCas9與SpCas9共享89.2%的序列相似性,這表明將其整合到CRISPR-Cas9編輯系統的當前模型中應該不太困難。 “ScCas9的氨基酸序列與SpCas9的氨基酸序列密切相關,因此預期它也很容易以重組形式生產,并且有望應用于SpCas9的所有應用。

 

“此外,ScCas9使用與SpCas9相同的引導RNA,因此來自不同公司的合成引導RNA可以通用。

 

該研究的下一步是繼續尋找更多的酶,這些酶可以增加CRISPR系統的靶標范圍,同時保持其準確性。與此同時,Chatterjee熱情推薦其他人能夠在自己的研究中充分利用新酶:“我們很高興ScCas9能夠進入基因組編輯應用家族,并希望獲得有關它們的反饋。

參考文獻:

Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog

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